转铁蛋白应用

2017-05-11

        蛋白分子量标准,常称之为蛋白Marker。在免疫印迹(Western blot)试验中,分子量Marker虽不起眼,但意义重大,是阳性对照,是大小的标准,是必须的。只有Marker精确无误了,实验结果才有说服力。除此之外,蛋白Marker还能够提示电泳是否正常,转移是否成功等信息。 
光阴似箭,日月如梭,不知不觉中蛋白Marker经历了普通Marker、预染Marker和曝光Marker三个发展阶段。

1.0代产品:普通蛋白Marker
普通蛋白Marker,或称之为未染色蛋白分子量标准,也叫预混(pre mixed)蛋白分子量Marker,是最简单,也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子,所示大小正好是蛋白原本的大小,是早期精确判断蛋白大小必备产品。普通Marker多数都选用预混和的Marker,方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有一个或者几个条带加倍浓度作为区别,用于帮助判断每个条带的大小。在选择上来说,当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的,越近越好。普通Marker不如预染Marker好用,因为电泳过程中完全看不到,要和目标蛋白一起等到最后染色才能见真容,无法对实验过程起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的,当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。按照条带的分子量大小通常有三种:宽分子量蛋白Marker、高分子量蛋白Marker、低分子量蛋白Marker。
从实验总体考虑的,应该选范围尽量宽,条带分布比较均匀的,这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断,避免正好落在一段空白区的风险。不过,条带越多,价格可能也会越贵。如果买的是大包装,就应该考虑分装。要考虑到反复冻融对蛋白的伤害,不能因为实验虐我,我就虐待蛋白吧。另外要知道,宽谱的Marker不一定每条都能看到的,特别是Mini Cell。还有,如果侧重大蛋白,那小的可能就已经跑掉了,跟质量无关。
在一般的蛋白电泳当中,低分子量Marker(PR1400)使用较多,除了有指示蛋白大小的作用以外,有时还可以用作粗略的定量。还有一类特别小的蛋白Marker,比如用于30kD以下蛋白或者多肽的。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白Marker挺不错,另外提醒一句,特别小的蛋白Marker条带如果要显色漂亮,上样量一定要足够。 

2.0代产品:预染蛋白Marker
预染蛋白分子量(prestained Marker),也叫预染Marker,是将Marker的蛋白,通过与染料共价耦联,在电泳过程中或者转膜时可以肉眼直接观察到的一种蛋白分子量Marker。预染Marker带来了很多方便,可以帮助我们在电泳时、电泳后,以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。比如,已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处,如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果;如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳。另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全。Marker和染料一同转移到膜上,可以方便的用来对照显色后的目标蛋白大小。预染Marker有这么多优点,所以现在应用的很多。值得注意的是,预染蛋白Marker与染料共价耦联,在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化,可能会导致一些偏差,所以不太适合精确定位蛋白。如果抛开分子量的偏差,预染Marker还是很好用的,也可以和普通Marker一起使用,做精确对比。 预染Marker可以分为两种:单色预染和多色预染(又称为彩虹Marker)。单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的,观察起来不是很方便。彩虹Marker(PR1910),比较容易区分条带的大小。还有一点特别要注意,由于转膜是一个将胶里的Marker转印膜上,所以需要的上样量相对少一些。如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”或者漂亮的单色Marker,往往需要比说明书里多加一些Marker的。省钱与美丽,背道而驰。

2.5代产品:间接曝光Marker
普通Marker和预染Marker还有一个缺点就是不能够在最终Western曝光的胶片或者扫描照片中显色,最终判断Western结果,还需要将照片和膜进行比对,容易出现偏差或者错误。很多产品在向最终的显色做努力,Biorad的Precision Plus Protein WesternC 就是其中的一例。该产品的所有条带都含有 Strep-标签,当使用 StrepTactin-HRP时可被化学发光检测最终显示在凝胶转印膜胶片或 CCD 图像中。这个好像有些复杂,需要辅助另外的产品,或者多余的步骤,我们就把该类产品定义为蛋白Marker的第2.5代产品,或者叫做的蛋白Marker 2S吧(apple手机的命名规则)。

3.0代产品:曝光Marker
说了这么多,大家也明白了蛋白Marker的第三代产品是什么样子的。3.0版本的蛋白Marker,就是最终的Marker条带会和检测目标蛋白会一同出现在显色的图片中,我们又称之为曝光Marker(Exposure Marker)。曝光Marker的原理是,每个条带蛋白都含有IgG结合位点,可以与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊以及兔子来源的IgG恒定区结合,因此在实验过程中这些蛋白可以直接或间接地结合二抗,与实验样品信号同时在X胶片上曝光显色。由此可以更方便准确地判断实验样品信号的位置和大小。
曝光Marker克服了使用常规预染 Marker评估蛋白转膜效率和样品抗原信号时所存在的一些不足。这些不足主要表现为:1、预染marker经过化学修饰后分子量与SDS-PAGE上表现的迁移率不一致;2、预染marker无法在X光胶片上显色,X光胶片上显色的条带需要与转移到膜上的预染 Marker比对才能确认蛋白的位置和大小,整个过程比较繁琐同时容易造成误差甚至是错误。3、也是最重要的一点,目的条带和曝光Marker出现在同一图片中,而不是后期的拼接,这样的结果更让别人信赖。现在很多大文章都在使用曝光Marker,可以预见,以后文献上逐渐都会使用曝光Marker。

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